Электрофизиологическое исследование ретино-тектальной системы рыб

Богатый репертуар зрительно управляемых поведенческих реакций у рыб обслуживается сравнительно просто устроенной зрительной системой, что делает рыб удобной экспериментальной моделью при исследовании общих принципов переработки и использования зрительной информации. В настоящее время нами проводится исследование нейронных механизмов восприятия движения на уровне ганглиозных клеток (ГК) сетчатки (детекторов движения разных типов), посылающих свои аксоны в основной зрительный центр рыб – крышу среднего мозга (тектум).

Исследованию ретино-тектальных проекций рыб было посвящено около десятка работ, проведенных в шестидесятых-восьмидесятых годах, в которых в общих чертах была установлена картина стратификации окончаний аксонов ГК в тектуме. Однако тогда не были проведены ни строгая классификация элементов, ни подробное исследование их свойств – в основном из-за ограниченности набора стимулов, предъявляемых от руки или механически.

Один из ключевых моментов методики – регистрация реакций ГК сетчатки от окончаний их аксонов в тектуме рыб тонкими заключенными в стекло металлическими платинированными микроэлектродами с очень низким сопротивлением (200-500 кОм). Другой определяющий момент – использование современных цифровых технологий для стимуляции, регистрации и управления экспериментом, что позволяет, в частности, оперативно применять широкий спектр разнообразных стимулов в ходе поиска адекватных признаков классификации регистрируемых элементов. В электрофизиологических опытах при отведении экстраклеточных реакций от окончаний аксонов ГК в тектуме рыб с предъявлением на мониторе разнообразных движущихся и стационарных стимулов применяется разработанная нами система управления экспериментом на основе трех связанных друг с другом синхронизованных компьютерных модулей: стимулирующего, регистрирующего и управляющего. Для оперативного управления параметрами стимуляции и регистрации разработан удобный в обращении интерфейс, позволяющий экспериментаторам легко ориентироваться в трех десятках параметров и быстро перестраивать программу опыта.

Исследовали реакции детекторов движения ретино-тектальной системы серебряного карася Carassius auratus gibelio Bloch: дирекционально-избирательных (ДИ) ГК, проецирующихся в верхний ретино-реципиентный слой тектума, и ориентационно-избирательных (ОИ) ГК, проецирующихся во второй ретинореципиентный слой. Разработаны системы классификационных признаков, проведена классификация детекторов движения и исследованы их свойства. Показано, что у рыб ДИ ГК представлены шестью физиологическими типами, различающимися по предпочтительным направлениям и по знаку предпочтительного контраста. В отличие от наземных позвоночных (кролика), ДИ ГК которых избирательны к четырем взаимно-перпендикулярным направлениям, у рыб они оказались избирательны к трем направлениям, отстоящим друг от друга примерно на 120° – Рис. 1а. Также в отличие от кролика, имеющего только смешанный ON OFF тип ДИ ГК, проецирующихся в крышу среднего мозга, рыбы имеют чистые on-клетки, отвечающие на введение в рецептивное поле (РП) светлой границы, и чистые off-клетки, отвечающие на введение темной границы. По остальным свойствам, включая размеры и структуру их РП, специфичность к форме и скорости движения стимулов, типы ДИ ГК рыб не отличаются друг от друга. Совпадение числа преимущественных направлений с числом полукружных каналов в вестибулярной системе говорит о том, что ДИ ГК, проецирующиеся в тектум рыб, могут быть вовлечены в систему мультимодальной сенсорной интеграции, обеспечивающей управление позой, локомоцией и движением глаз рыб в подвижной водной среде.

В отличие от ДИ элементов ОИ элементы ретино-тектальной системы рыб делятся всего на два физиологических типа с взаимно ортогональными предпочтительными ориентациями – Рис. 1б. В боковом поле зрения эти ориентации близки к вертикали и горизонтали – «детекторы вертикального и горизонтального краев». И те, и другие детекторы (в отличие от ДИ ГК) являются элементами on-off-типа. По всем остальным свойствам, кроме ориентации, ОИ ГК неотличимы друг от друга. ОИ ГК известны и у других животных, но функциональная роль их не ясна.

 Рис. 1. Полярные гистограммы распределения предпочтительных направлений движения стимулов для ДИ ГК (а) и ОИ ГК (б), регистрируемых в тектуме карася. По радиусам отложено количество клеток в каждом угловом секторе. Цифры рядом с отдельными модами гистограмм обозначают суммарное количество зарегистрированных клеток соответствующего типа.

В колориметрических исследованиях детекторов движения ретино-тектальной системы рыб с использованием высококонтрастных цветных стимулов показано, что любые пары цветов можно уравнять изменениями интенсивности, что говорит о цветовой слепоте этих элементов. Измерена относительная спектральная чувствительность детекторов движения. У всех шести типов ДИ ГК и обоих типов ОИ ГК она оказалась примерно одинаковой и сосредоточена в красном конце спектра, однако определяется не только красными колбочками, но также и зелеными и синими, которые вносят слабый вклад с отрицательным знаком. Это можно считать приспособлением к водной среде, где из-за существенного рассеяния в сине-зеленой области спектра четкое видение возможно только в красном его конце.

Чувствительность нейронов первичной зрительной коре кошек к абсолютной глубине

При исследовании экстрастриарных зон коры мозга кошки была обнаружена зона с необычной организацией. Рецептивные поля нейронов этой зоны были сильно вытянуты и ориентированы как спицы колес радиально на центры сетчатки (Рис. 2).

             Рис. 2. Топография рецептивных полей экстрастриарных зон коры мозга кошки.

Аналогичная зона была обнаружена нами и в коре обезьян, где она совпала с ранее упоминавшейся, но практически не исследованной зоной V4A. Этого названия мы будем придерживаться и для аналогичной зоны в коре кошек. Радиальная организация зоны V4A наталкивала на предположение об особой ее роли в анализе зрительной информации в процессе поступательного движения животного (в т.н. анализе оптического потока). Для исследования активности нейронов зоны V4A была построена специальная установка (Рис. 3), где платформа с кошкой и всей сопутствующей регистрирующей аппаратурой (а) двигалась по рельсовому пути (б) по направлению к стационарной трехмерной зрительной сцене - гофрированному экрану (в).

             Рис. 3. Экспериментальная установка.

В ходе этих опытов было обнаружено, что часть нейронов зоны V4A обладают абсолютной чувствительностью к расстоянию до зрительной сцены. Эти нейроны демонстрировали разный уровень активности при расположении кошки вдали от экрана (3 м), или вблизи от него (25 см). Для исследования этих нейронов, чтобы обеспечить сходные сетчаточные изображения сцены при положении животного вблизи и вдали, в центре большого экрана располагали его пропорционально уменьшенную копию (Рис. 3г). Активность одного такого нейрона показана на Рис. 4. Здесь сверху (а) схематически показана траектория движения кошки. Снизу (б) дана усредненная по десяти прокатам активность нейрона в зрительной зоне V4A. Черная линия - среднее значение. Серое облако - ± 2 стандартных ошибки среднего. Кривая отражает изменение во времени частоты импульсации нейрона. При положении кошки вблизи от экрана активность нейрона была низкой. Затем возрастала в процессе отъезда платформы от экрана и оставалась постоянно высокой в течение всего времени нахождения животного вдали от экрана.

                Рис. 4. Активность нейрона чувствительного к расстоянию до зрительной сцены.

Удивительным оказалось то, что нейроны с аналогичной чувствительностью к глубине были найдены нами и в первичной зрительной коре, на ранних этапах обработки зрительной информации. Сейчас начато специальное исследование этих нейронов в первичной зрительной коре.

И.Н. Пигарев принимал участие в исследованиях, проводимых нашими коллегами в Мельбурнском Университете (Австралия). В этих опытах были раскрыты механизмы, обеспечивающие увеличение ответов нейронов зрительной коры обезьян при направлении внимания на стимул.

Исследование активности нейронов коры головного мозга млекопитающих в состоянии сна и боодрствования

Эксперименты по изучению зрительной системы проводятся в хронических экспериментах на бодрствующих животных. В процессе монотонных опытов животные устают и начинают засыпать. В последние годы мы стали совмещать эти работы с изучением состояния сна.

Ранее нами было обнаружено, что нейроны коры мозга, в частности, и нейроны зрительной коры во сне начинали отвечать на электрическую стимуляцию кишечника и желудка. Пример такого ответа приведен на Рис. 5. На верхней гистограмме показан ответ нейрона на электрическую стимуляцию кишечника во время сна (момент стимуляции отмечен вертикальными серыми линиями). Ответы на такую же висцеральную стимуляцию прекращались сразу после пробуждения (нижняя гистограмма).

               Рис. 5. Пример ответа нейрона зрительной коры на электрическую стимуляцию кишечника и желудка во время бодрствования и во сне.

 Переключение корковой активности на обработку висцеральной информации в период сна было подтверждено нами в совместных исследованиях с испанскими коллегами в экспериментах на обезьянах. На Рис. 6 приведены усредненные (n – число усреднений) электрические ответы коры обезьяны, вызванные электрической стимуляцией кишечника во сне (сверху) и в бодрствовании (снизу). Аналогичные результаты были получены и в ответ на магнитную стимуляцию живота.

            Рис. 6. Усредненные (n – число усреднений) электрические ответы коры обезьяны, вызванные электрической стимуляцией кишечника во сне (сверху) и в бодрствовании (снизу).

Детально вызванные ответы коры на интраперитонеальную электрическую стимуляцию были исследованы в экспериментах на кроликах, где при компонентном анализе этих ответов была обнаружена сложная их динамика по ходу сна. Эти опыты впервые показали наличие топографической организации представительства висцеральных систем, проявляющейся только в состоянии сна. В бодрствовании те же отделы коры вовлекаютя в анализ экстероцептивной сенсорной информации.

В последние годы совместно с лабораторией ныне покойного проф. В.А. Багаева из Института физиологии им. И.П. Павлова РАН в С.-Петербурге мы отошли от искусственной электрической или магнитной стимуляции и начали исследование отражения в активности коры мозга естественной фоновой активности висцеральных органов. В гладкомышечные стенки желудка и кишечника имплантировали регистрирующие электроды и проводили сопоставление миоэлектрической активности этих органов в состоянии сна с активностью отдельных нейронов зрительных зон коры мозга и с суммарной электроэнцефалограммой. Для возможности автоматического анализа миоэлектрической активности и последующей статистической обработки результатов были написаны специальные программы. Результаты этого исследования показали, что естественная активность органов желудочно-кишечного тракта отражается (и видимо определяет) активность значительной доли нейронов коры мозга в состоянии сна. Пример одновременно зарегистрированной миоэлектрической активности кишечника и коркового нейрона приведен на Рис. 7.

             Рис. 7. Одновременная регистрация миоэлектрической активности кишечника и коркового нейрона.

Здесь показана активность на протяжении трех перистальтических кишечных циклов (б, серая кривая). Усреднение проведено по отрицательному пику среднего цикла. Сверху (а, черная кривая) представлена усредненная кривая, отражающая частоту импульсации коркового нейрона. Видно их хорошее совпадение. В состоянии сна у 30% нейронов зрительных зон коры была показана достоверная связь с активностью органов желудочно-кишечного тракта. У 25% нейронов показана связь с ритмикой дыхания. Эти эксперименты показывают важную роль процесса сна в управлении работой висцеральных систем организма и подчеркивают значение гигиены сна для здоровья. Кроме того, вовлечение одних и тех же нейронных систем в обработку как экстероцептивной (в бодрствовании) так и интероцептивной (во сне) информации заставляет пересмотреть существующие представления об организации и взаимодействии мозговых структур.

Частотная перестройка слуховой системы ночных чешуекрылых

На основе анализа физических закономерностей восприятия акустических сигналов ночными чешуекрылыми (Noctuidae, Lepidoptera) нами была предложена гипотеза о переменности частотной настройки тимпанальной системы этих насекомых. Из гипотезы следовало, что бабочки могут подстраиваться к параметрам биологически важных сигналов. Кроме того, подобная система потенциально способна производить последовательный частотный анализ воспринимаемых звуков. Аналогичный принцип используется в технических системах, но в животном мире не был известен.

В серии электрофизиологических экспериментов проведено исследование возможности перестроек частотно-пороговых характеристик слуховой системы бабочек-совок при искусственно вызванном сокращении мышц метаторакса. Аппликация хлорида калия в гемолимфу метаторакса в течение нескольких минут приводила к сокращению прилежащих мышц и росту слуховых порогов на низких частотах (в диапазоне 10–30 кГц на 10–14 дБ), в то время как на частотах выше 60 кГц разница в порогах до и после введения хлорида калия была обратной. Разнонаправленные изменения слуховой чувствительности на низких и высоких частотах можно объяснить одновременным действием двух факторов: перестройкой частоты тимпанальной мембраны от 24 кГц до 48–50 кГц за счёт ее продольного растяжения мышцами метаторакса и общим падением чувствительности тимпанальной системы насекомого. В нескольких опытах наблюдались аналогичные перестройки, происходившие самопроизвольно, то есть без действия препарата, вызывающего сокращение мышц.

В ходе этих исследований у совок были обнаружены признаки активной настройки слуховой системы на несущую частоту воспринимаемого сигнала. В процессе такой настройки резко (в 6–8 раз) возрастала слуховая чувствительность к стимулам с частотой заполнения 80–100 кГц. По комплексу признаков, в частности, по динамике нарастания и спада нейронной импульсации при воздействии стимулов с околопороговыми интенсивностями был сделан вывод, что на периферическом уровне слуховой системы происходит перестройка высокодобротного механического резонанса к несущей частоте воспринимаемого сигнала.

Данные электрофизиологических экспериментов были проверены в серии поведенческих тестов. Совок двух видов Enargia paleacea Esp. и Blepharita satura Schiff. стимулировали в условиях закреплённого полёта акустическими пульсами, следовавшими с задержкой относительно собственных эхолокационных щелчков. В качестве признака ответной реакции бабочки использовали учащение эмиссии щелчков. При интервале 1 мс между щелчками бабочки и началом стимулирующих пульсов минимальные пороги реакций наблюдались в диапазоне частот 40–60 кГц, но при увеличении задержки до 12 мс зона оптимума слухового восприятия смещалась к частоте 20 кГц. При задержке 6 мс оптимум занимал промежуточное положение (в среднем на 30 кГц). Эти опыты подтвердили нашу гипотезу, согласно которой у совок могут происходить быстрые перестройки частотной характеристики слуховой системы.

В других поведенческих экспериментах на совках Scoliopteryx libatrix L. было показано, что пороги защитных реакций этих насекомых (остановки полёта) на стимулы с шумовым заполнением в 1.5–4 раза превышают пороги на моночастотные посылки равной длительности. Этот эффект нельзя объяснить меньшей чувствительностью слуховой системы бабочек к шумоподобным звукам, поскольку другие типы поведенческих реакций насекомых, например, рыскание по курсу, наблюдались примерно на одних и тех же уровнях, независимо от типа заполнения стимулирующих пульсов. Эти результаты указывают на способность тимпанатных чешуекрылых различать акустические сигналы по степени их широкополосности, то есть на их способность к последовательному частотному анализу воспринимаемых звуков.

         Рис. 1. Частотно-пороговые характеристики совок B. satura, полученные при трёх значениях задержек стимулов относительно собственных щелчков бабочек (обозначения - в верхней части рисунка. По горизонтальной оси - частота заполнения стимулирующих посылок, по вертикальной - порог реакций. Каждая кривая построена по результатам усреднения данных 8 однотипных опытов.

Офтальмологические исследования

Основная цель офтальмологических исследований сотрудников лаборатории последних лет – создание адекватного представления о механизмах аккомодации у человека и развитии этих механизмов в постнатальном онтогенезе. Анализ обширной литературы и собственных экспериментальных данных выявил противоречивость принимаемой большинством офтальмологов концепции эмметропизации, согласно которой глаз человека претерпевает постепенное превращение из гиперметропического (дальнозоркого) у младенцев в эмметропический (соразмерный, нормальный) у подростков. Ключевое для данной концепции понятие эмметропического глаза опирается на устаревшее представление Гельмгольца, считавшего, что в состоянии покоя аккомодации нормальный глаз должен быть настроен на бесконечность. Однако к настоящему времени твердо установлено, что у подавляющего большинства людей покой аккомодации соответствует вовсе не бесконечности, а некоторой весьма близкой зоне. Значит, понятие «эмметропический глаз» в прежнем виде - это фикция, и его нельзя рассматривать как образец, к которому стремится развивающийся глаз ребенка.

Офтальмологи обычно игнорируют то обстоятельство, что при оценке рефракции глаза в естественных условиях (без циклоплегии) у большинства младенцев обнаруживается не гиперметропия (характерная для условий циклоплегии), а миопия. Это расхождение легко объяснить, учитывая особенности функционирования зрительной системы младенцев.

Почему измерения рефракции в естественных условиях выявляют у младенцев миопию, т.е. удовлетворительную настройку глаза только на близкие расстояния? Скорее всего потому, что наиболее важные для жизни объекты находятся в непосредственной близости от глаз (Рис. 1а). В первые недели жизни сильно выпуклый и почти нерегулируемый хрусталик автоматически обеспечивает относительно хорошую фокусировку близких объектов. Более того, при учете типичных условий рассматривания ребенком лица матери в первые месяцы жизни удается понять специфическое и, на первый взгляд, странное распределение рецепторов в сетчатке новорожденных, характеризующееся повышенной плотностью не в центре сетчатки, а в кольце диаметром около 5^о. Когда ребенок находится на руках у матери, в область такого кольца на сетчатке как раз попадают проекции наиболее важных для идентификации и наиболее контрастных элементов лица: глаз и рта (Рис. 1б).

            Рис. 1. Наиболее важный для младенца объект (а) и сопоставление кольца максимальной плотности рецепторов в сетчатке с проекцией лица человека (б).

Почему измерения в условиях циклоплегии выявляют у младенцев гиперметропию? Прежде чем ответить на этот вопрос, подчеркнем, что показатель рефракции в условиях паралича цилиарной мышцы отражает вовсе не состояние настройки глаза на бесконечность, а состояние предельного расслабления мышцы, т.е. предел изменения ее тонуса для изменения фокуса в сторону увеличения. Этот предел соответствует сумме рефракции, требующейся для точной настройки на бесконечность (0 дптр), и амплитуды изменений рефракции, необходимой для нахождения оптимума фокусировки. Из-за низкой контрастной чувствительности младенцам нужно более значительное изменение фокуса, чем взрослым, чтобы зафиксировать повышение/снижение четкости сетчаточного изображения и найти оптимум фокусировки. Если большинство взрослых замечает расфокусировку в 0.1–0.2 дптр, то младенцам для этого требуются единицы диоптрий. Именно с этим может быть связана значительная кажущаяся «гиперметропия» младенцев в условиях циклоплегии: она отражает потенциальную способность аккомодационной системы младенцев дальше сдвигать фокус относительно сетчатки.

В ходе развития ребенка параллельно повышению контрастной чувствительности, естественно, уменьшается и необходимая амплитуда сдвига фокуса относительно сетчатки, что должно приводить к постепенному уменьшению «гиперметропии», регистрируемой в условиях циклоплегии. Именно такая динамика рефракции была описана многими авторами и послужила основой концепции эмметропизации. Однако, на наш взгляд, эта динамика отражает не превращение глаза из гиперметропического в эмметропический, а постепенное уменьшение амплитуды флуктуаций аккомодации, необходимых для фокусировки сетчаточных изображений, в связи с повышением контрастной чувствительности. Поскольку зрелой системе для нахождения оптимума достаточно 0.1–0.2 дптр, предельное положение фокуса у взрослых приближается к 0 дптр – состоянию настройки на бесконечность.

Новые представления о работе аккомодационного механизма коррелируют с нашими данными, полученными в результате параллельных измерений клинической рефракции и остроты зрения у школьников (Рис. 2). Эти данные демонстрируют наличие повышенных значений остроты зрения на промежуточных расстояниях (в зоне покоя аккомодации) при разных значениях клинической рефракции. Существование оптимумов, по-видимому, связан с тем, что используемые для оценки остроты зрения мелкие околопороговые стимулы не могут удовлетворительно обеспечивать контроль аккомодации, а в отсутствие эффективных аккомодационных стимулов система имеет тенденцию «скатываться» к состоянию покоя (уровню тонической аккомодации). В результате, вблизи точки, соответствующей этому уровню, фокусировка будет относительно хорошей и стабильной даже при мелких стимулах, а при удалении от этой точки в обе стороны вероятность сбоев и ошибок будет увеличиваться.

      Рис. 2. Средние значения остроты зрения для разных расстояний наблюдения у младших школьников с различной клинической рефракцией (от -2.0 до + 1.0 дптр).

Полученные результаты важны не только для формирования адекватного представления о работе аккомодационного аппарата человека, но и для офтальмологической практики. Во-первых, они указывают на целесообразность изменения структуры таблиц или процедур для точной оценки остроты зрения. Во-вторых, их нужно учитывать при разработке новых методов лечения и профилактики миопии. В частности, в предварительных экспериментах нами показано, что добавление специальных фоновых аккомодационных стимулов к тренировочным тест-объектам может способствовать повышению остроты зрения для дали за счет стабилизации и усиления сигналов обратной связи.

Приборы для исследования критической частоты слития мельканий

Разработана компьютерная система для исследования критической частоты слияния мельканий (макулярная и мультифокальная  КЧСМ на цветные стимулы), электрической чувствительности и лабильности зрительного нерва, и для проведения терапевтических сеансов светотерапии  и электростимуляции. Система содержит автономное микропроцессорное устройство для исследования КЧСМ  в  З6 точках  поля зрения  и блока электростимуляции с возможностью управления от персонального компьютера через USB-порт или по радиоканалу. Разработаны методики выявления некоторых патоло-гических изменений зрительного тракта на ранней стадии заболевания и проведения восстановительной терапии. Предварительные испытания отдельных компонентов системы в ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им.  акад. С.Н. Федорова и МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца показали высокую эффективность диагностики и лечения зрения. Работа выполнялась по гранту.

Был разработан  компьютерной  вариант прибора для исследования КЧСМ с условным названием «Блик-5», который в настоящее время проходит испытание в МНИИ ГБ им. Гельмгольца,  для  динамического  исследования  зрения детей с высокой степенью миопии.

           БЛИК-5

Разработаны варианты прибора «Радуга–3ДЛ», приборы «Радуга–4ДЛ» и «КЧСМ–ЭЛ», в последнем объедены два метода диагностики: исследования КЧСМ и исследование электрической чувствительности и лабильности зрительного нерва. При этом на  основе полученных показателей устанавливается режим терапевтической светостимуляции.

          Радуга–4ДЛ

           КЧСМ–ЭЛ

Исследование хеморецепции человека и животных

Среди проблем химической коммуникации вопросы индивидуального узнавания животных и человека по запаху разработаны в наименьшей степени. Это связано с большими методическими трудностями выявления индивидуально значимых веществ, среди огромного количества обонятельных стимулов неизвестной химической природы, выделяемых особью. Однако, уже очевидно, что индивидуальные запаховые коды содержат большое количество информации о каждой особи и играют огромную роль в поведении человека и животных. Например, в выборе брачного партнера - одной из наиболее ответственных задач в жизни любого организма, способного к такому выбору. От того, насколько удачным окажется сочетание генов двух родителей, зависит судьба потомства. Необходимо выбрать не просто партнера, а партнера, наиболее подходящего именно для особи осуществляющей выбор, наиболее комплементарный генотип. Не подлежит сомнению, что у млекопитающих индивидуальный запах, во-первых, специфичен для каждой особи, и, во-вторых, несет большой объем информации о генетическом статусе. Эта информация расшифровывается сородичами, причем в ее интерпретации большую роль играет сравнение данных о статусе «тестируемого» индивида с аналогичными данными о самом себе. От результатов таких сравнений часто зависит выбор брачного партнера. Экспериментально доказана связь половых предпочтений у млекопитающих с главным комплексом гистосовместимости (MHC) или HLA у человека. Мы предположили, что такой важной информацией могут быть сведения о факторах крови, например, системах АВ0 и резус.

Известно, что частота встречаемости резус-отрицательного аллеля d составляет среди жителей Восточной Европы около 15%, следовательно вероятность образования пары, в которой оба супруга резус-отрицательны составляет 0,02. При опросе случайно 224 выбранных супружеских пар оказалось, что в 38 из них оба супруга резус-отрицательны. Этот результат свидетельствует о том, что выбор партнера по этому далек от случайного. Источникам информации о резусе большой вероятностью служит индивидуальный запах, в чем мы попробуем убедиться в дальнейшем. Наличие индивидуального запаха у млекопитающих не подлежит сомнению. А существует ли индивидуальный запах у беспозвоночных животных? Сведения об индивидуальном запахе у беспозвоночных животных очень скудны. В первую очередь это обусловлено тем, что при работе на беспозвоночных очень трудно убедиться в том, что индивидуальное распознавание присуще этим животным. Первый вопрос, на который необходимо получить ответ при исследовании индивидуального распознавания по запаху – а есть ли вообще индивидуальный запах у данного вида животных. Для ответа на этот вопрос мы использовали специально обученных собак. Собака - редкий по доступности и изученности вид для которого доказано, что она запоминает и узнает различные смеси запахов, выделяя их из еще более сложных смесей, что используется в криминалистике, службе безопасности. Собаке недоступны другие ключи индивидуального распознавания (окраска, акустические сигналы и т.д.), она может руководствоваться только запахом, поэтому использование собак позволяет узнать возможно ли для каких-то животных дистантное индивидуальное распознавание по запаху. Взяв за основу метод множественного выбора по образцу, который применяется в криминалистике для идентификации индивидуальных запахов людей, мы показали, что собака легко выбирает одну особь некоторых видов насекомых в ряду других особей того же вида, пола, возраста и т.д, то есть по крайней мере особям 5 видов насекомых присущ индивидуальный запах.

Изучение проблем видообразования у насекомых

Наши исследования направлены на решение таких фундаментальных проблем видообразования как порядка возникновения изолирующих механизмов и темпов видообразования. Как показывают многочисленные данные, накопленные в последние десятилетия, во многих случаях оказываются первичны прекопуляционные изолирующие механизмы, в частности, этологическая изоляция. К настоящему времени среди самых различных групп животных известны примеры близкородственных видов, различающихся лишь по брачным сигналам или сигналам ухаживания (mating signals). Эти виды могут быть сходны морфологически и способны скрещиваться в лабораторных условиях в отсутствии выбора, производя жизнеспособное потомство, однако практически не скрещиваются в природе. Очевидно, что между этими видами выработаны только этологические изолирующие механизмы. Такие виды оказываются идеальными объектами исследований роли полового отбора в видообразовании.

           Рис. 3. Схема акустической коммуникации саранчовых подсемейства Gomphocerinae.

Основной объект наших исследований – саранчовые подсемейства Gomphocerinae (Insecta, Orthoptera). Саранчовые активно используют акустические сигналы для поиска полового партнера (Рис. 3). Самцы издают так называемые призывные сигналы для привлечения самок на расстоянии, рецептивные самки также могут отвечать акустически, после чего они сближаются. Когда же самец оказывается рядом с самкой, он издает сигнал ухаживания, который у многих видов оказывается более длительным и сложным по амплитудно-временной структуре, чем призывный сигнал, кроме того, он может сопровождаться визуальными сигналами, например, специфическими движениями частей тела. Призывный сигнал должен обладать высокой помехоустойчивостью, т.е. содержать набор признаков, которые надежно детектируются на фоне шума и других одновременно поющих видов прямокрылых. Было показано, что призывные сигналы одного вида из разных географических точек обладают стабильностью и относительно мало изменчивы (Vedenina, Bukhvalova, 2001). Сигналы ухаживания, напротив, обладают более высокой изменчивостью. Перед особями противоположного пола стоит задача не только распознать конспецифическую особь, но и оценить ее «качество». Вариабельный сигнал дает большую возможность самкам для выбора и самцам для соревнования, особенно при определенных стратегиях полового поведения, например, при «токах», характерных для ряда видов саранчовых (Веденина, 2005). Цель нашей работы – показать, что сигналы ухаживания саранчовых могут быстро эволюционировать под действием полового отбора.

Мы исследовали близкородственные виды группы Chorthippus albomarginatus, которые сходны не только по морфологическим признакам, но и по призывным сигналам. Пять европейских видов этой группы занимают разные ареалы, которые в ряде случаев образуют контактные зоны. Нами было показано, что два вида, Ch. albomarginatus и Сh. oschei, гибридизируют в контактной зоне на территории Украины и Молдавии (Vedenina, Helversen, 2003), что свидетельствует о неокончательно установленных изолирующих барьерах у данных видов. Изучение жизнеспособности лабораторных F₁ и F₂ гибридов выявило очень незначительное, хотя и достоверное, снижение жизнеспособности гибридов по сравнению с потомством родительских видов. Это свидетельствует о слабой посткопуляционной изоляции. Поведенческие эксперименты, проведенные в условиях равного выбора, показали высокую избирательность самок родительских видов: в 80–90% случаев самки выбирали самцов своего вида (Веденина и др., 2007). Таким образом, прекопуляционная изоляция между данными видами относительна велика.

При выборе между родительскими видами и гибридами, самки демонстрировали неодинаковую избирательность: самки Ch. albomarginatus были менее селективны, чем самки Ch. oschei. Гибридные самки также предпочитали самцов Ch. albomarginatus самцам Ch. oschei. Эти результаты говорят о том, что сигнал Ch. albomarginatus можно считать более древним, чем сигнал Ch. oschei. Это предположение подтвердилось в ходе генетического анализа сигналов ухаживания. Мы анализировали не только акустический компонент сигнала, но и моторику движений ног. Оказалось, что сигналы F₁ и F₂ гибридных самцов несут в себе больше признаков Ch. albomarginatus, чем Ch. oschei (Vedenina et al., 2007).

Примечательно, что гибридные сигналы несли в себе новые признаки, не характерные для родительских сигналов. Генетический анализ количественных признаков также показал, что наследование различных параметров сигнала ухаживания наиболее согласуется с III типом генетической архитектуры, которая подразумевает дуплицированные пары локусов и неаллельные взаимодействия. Этот тип генетической архитектуры может обеспечить появление новых элементов в гибридных песнях, и, таким образом, предоставляет богатый материал для полового отбора (Vedenina et al., 2007).

К настоящему времени получены новые, еще неопубликованные данные по структуре гибридных зон между Ch. albomarginatus, Ch. oschei и третьим видом данной группы, Ch. karelini, на территории Украины. Предварительный анализ предполагает, что гибридные зоны не расширяются, а они скорее стабилизированы, или даже в них происходит усиление прекопуляционных изолирующих барьеров.

Чтобы понять, как соотносится время дивергенции видов группы Ch. albomarginatus с другими видами саранчовых подсемейства Gomphocerinae, мы начали проведение молекулярного анализа последовательностей митохондриального гена COI и ядерных генов ITS1 и ITS2 совместно с сотрудниками ИБР РАН им. Н.К. Кольцова. Анализ выявил минимальные различия между видами группы Ch. albomarginatus, сравнимые с межпопуляционными различиями у некоторых других видов. В ближайшее время предполагается сравнить виды с разной стратегией поиска полового партнера. Мы ожидаем, что молекулярный анализ выявит большие различия между близкородственными видами, которые не ухаживают, тогда как виды, демонстрирующие сложное поведение ухаживания, будут различаться малым числом замен нуклеотидов. Это будет свидетельствовать, что темпы видообразования в подсемействе Gomphocerinae различны в группах видов с разной стратегией полового поведения.

Сравнительно недавно еще одним объектом наших исследований, направленных на решение проблем видообразования, стали близкородственные виды группы Drosophila virilis (Insecta, Diptera). У данных видов поведение ухаживания представляет собой последовательность стереотипных актов, включающих в себя химическую, акустическую, зрительную и тактильную коммуникацию. Однако на данный момент недостаточно исследована видоспецифичность ритуалов ухаживания у близкородственных видов, в частности, какой компонент сигнала ухаживания является ключевым для распознавания вида, а какой – для определения «качества» партнера. В ходе поведенческих экспериментов на шести близкородственных видах группы D. virilis показано, что ухаживание за гетероспецифической самкой, как правило, прекращалось на первой стадии обмена химическими сигналами, стадии ощупывания. Мы предполагаем, что роль контактной хеморецепции в распознавании полового партнера в данной группе видов особенно велика. Нами были получены F1 и F2 гибриды между парами видов D. virilis и D. lummei, D. аmericana и D. littoralis, что свидетельствует об отсутствии посткопуляционных изолирующих барьеров. В дальнейшем планируется продолжить эксперименты по межвидовым скрещиваниям как интактных, так и оперированных особей (операция подразумевает удаление того или иного компонента сигнала ухаживания).